Pseudomonas aeruginosa small RNA는 만성 및 급성 감염을 조절합니다

Nature 618권, 358~364페이지(2023)이 기사 인용

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서로 다른 생활방식 사이를 전환할 수 있는 능력을 통해 박테리아 병원균은 다양한 생태학적 틈새에서 번성할 수 있습니다1,2. 그러나 인간 숙주 내에서의 생활 방식 변화에 대한 분자적 이해가 부족합니다. 여기서 우리는 인간 유래 샘플에서 박테리아 유전자 발현을 직접 조사함으로써 기회 감염 병원체인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 만성 감염과 급성 감염 사이의 전환을 조정하는 유전자를 발견했습니다. 여기에서 sicX로 명명된 이 유전자의 발현 수준은 인간의 만성 상처 및 낭포성 섬유증 감염에서 발현되는 P. aeruginosa 유전자 중 가장 높지만 표준 실험실 성장 중에는 극히 낮은 수준으로 발현됩니다. 우리는 sicX가 저산소 조건에 의해 강력하게 유도되고 전사 후 혐기성 유비퀴논 생합성을 조절하는 작은 RNA를 인코딩한다는 것을 보여줍니다. sicX를 삭제하면 P. aeruginosa가 여러 포유류 감염 모델에서 만성 생활 방식에서 급성 생활 방식으로 전환됩니다. 특히, sicX는 만성 감염이 분산되어 급성 패혈증을 유발할 때 가장 하향조절되는 유전자이기 때문에 만성에서 급성으로의 전환에 대한 바이오마커이기도 합니다. 이 연구는 P. aeruginosa의 만성에서 급성으로의 전환을 뒷받침하는 분자 기반에 관한 수십 년 된 질문을 해결하고 산소가 급성 치사율의 주요 환경 동인임을 시사합니다.

많은 병원성 박테리아는 숙주에 정착하여 만성적으로 지속될 수 있습니다. 어떤 경우에는 박테리아가 초기 감염 부위에서 다른 신체 부위로 전파되어 급성 전신 질환을 초래합니다. 생물학의 핵심 질문은 이러한 라이프 스타일 전환을 제어하는 분자 메커니즘과 환경 신호를 이해하는 것입니다. 기회감염 인간 병원체 P. aeruginosa는 치료하기 매우 어려운 급성 및 만성 감염을 모두 일으킬 수 있습니다. P. aeruginosa는 각각 급성 및 만성 감염을 선호하는 것으로 간주되는 단일 세포(플랑크톤 생활 방식) 또는 매트릭스로 둘러싸인 집합체(생물막 생활 방식)로 존재합니다. 따라서 실험실 연구는 전통적으로 인간의 이 병원체의 생활 방식 변화를 이해하는 것을 목표로 P. aeruginosa의 생물막-플랑크톤 전이를 시험관 내에서 조사하는 데 중점을 두었습니다. 수십 년간의 연구를 통해 두 번째 메신저 순환 di-GMP3,4,5 및 Gac-Rsm 시스템2,6,7,8,9,10,11,12과 같은 글로벌 규제 시스템이 어떻게 P의 생물막-플랑크톤 전이를 제어하는지 보여주었습니다. aeruginosa를 시험관 내에서 분석하여 이 박테리아의 생활사에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 그러나 지금까지 P. aeruginosa가 어떻게 환경 신호에 반응하고 이에 따라 포유류 숙주 내에서 감염 생활 방식을 바꾸는지는 파악하기 어렵습니다. 이 연구에서 우리는 인간 유래 샘플에서 획득한 P. aeruginosa 전사체를 활용하여 P. aeruginosa 만성 감염을 지배하는 만성 감염 X(SicX)의 sRNA 유도자라고 불리는 새로운 작은 RNA를 발견하고 기계적으로 특성화함으로써 이러한 지식 격차를 해결했습니다. 또는 포유동물 감염 중 급성 결정.

우리는 이전에 낭포성 섬유증 환자의 객담 샘플과 만성 상처 환자의 괴사조직 샘플을 포함하여 인간 감염 샘플에서 고해상도 P. aeruginosa 전사체를 얻었습니다. 기계 학습 방법을 사용하여 우리는 발현 수준이 실험실에서의 P. aeruginosa 성장과 인간의 P. aeruginosa 성장을 집합적으로 구별하는 30개의 P. aeruginosa 유전자를 식별했습니다13. 이들 유전자 중 절반 이상이 특성화되지 않았으며, 이는 P. aeruginosa 인간 감염 생물학에 대한 지식의 상당한 격차를 강조합니다. 기능이 알려지지 않은 이러한 유전자에는 PA1414(P. aeruginosa 균주 PAO1의 유전자좌 태그)가 포함되어 있으며, 인간에서의 발현 수준은 실험실의 발현 수준보다 222배 높았으며, 이 발현 수준은 발현된 P. aeruginosa 유전자 중 가장 높습니다. 인간 감염 중 (그림 1a). 다음으로 우리는 PA1414 전사체의 상대적 존재비(백만 개당 전사체(TPM))를 다른 단백질 코딩(5,893개 유전자) 및 비코딩(199 sRNA) 전사체와 비교했습니다(그림 1b). 평균적으로 PA1414 전사체는 인간 만성 감염 샘플에서 획득한 P. aeruginosa 전사체에서 TPM의 13.85%를 나타냈으며, 특히 어떤 경우에는 전체 TPM의 거의 50%를 구성했습니다. 그러나 표준 시험관 내 조건에서 성장한 P. aeruginosa에서는 PA1414 발현 수준이 매우 낮았습니다. PA1414는 기능이 알려지지 않은 작은 유전자(234개 염기쌍 길이)입니다. 261개의 완전한 P. aeruginosa 게놈을 조사한 결과 258개의 PA1414 상동체가 확인되었으며(그림 1c 및 확장 데이터 그림 1), 다른 Pseudomonas 종이나 다른 유기체에서는 상동체가 확인되지 않았습니다. 업스트림 프로모터 영역을 포함하는 PA1414 오솔로그의 DNA 서열은 고도로 보존되어 있으며(그림 1d), 이는 PA1414가 보존된 기능을 가지고 있으며 그 발현 조절이 P. aeruginosa 분리주 전체에 걸쳐 보편적이라는 것을 시사합니다.

2, |log2[fold change]| > 1) for identifying differentially expressed genes. The upregulated (green) and downregulated (blue) genes in humans are colour-coded differently. Grey bubbles indicate genes that are not differentially expressed. b, Relative transcript abundance (TPM) of PA1414 compared to those of all other protein-coding sequences (CDSs) and non-coding sRNAs in 54 transcriptomes examined in a, sorted from the highest to the lowest PA1414 TPM. Average PA1414 TPM is indicated with dashed lines. c, PA1414 orthologues are found only in P. aeruginosa. Green and black bars indicate the presence and absence of orthologues, respectively. d, DNA sequence conservation of PA1414 and its neighbouring genes among 258 PA1414-containing P. aeruginosa isolates. Below, the percentage of orthologues identical to the PA1414 allele from PA14 at each nucleotide is shown./p> 103, PA1414 ranking < 102) for identifying transcriptomes with high PA1414 expression. b, β-galactosidase assay examining the induction of PA1414 under anaerobic and static conditions. PPA1414-lacZ, lacZ transcriptionally fused to PA1414 promoter; PPA1414*, PA1414 promoter containing mutations in the Anr-binding motif; MrT7, MAR2xT7 transposon. n ≥ 4 independent experiments. c, Northern blot analysis of PA1414 expression. Estimated size (nucleotides, nt) are indicated on the left. 5S rRNA served as a loading control. For gel source data, see Supplementary Fig. 1. d, Colony biofilm growth of ΔPA1414 and WT in different P. aeruginosa strain backgrounds. The presence and absence of oxygen are indicated. The CFU of ΔPA1414 was normalized against the CFU of the WT in each experiment (n = 4). A dashed line highlights the point where the CFU ratio = 1. e, Percentage of tetracycline-resistant (TetR) cells before and after daily passages under anaerobic conditions (n = 3). TetS, tetracycline sensitive; Δ, ΔPA1414. f, RNA-seq reads aligned to the PA1414 locus during standard in vitro growth and human infections. Blue shade indicates Rho-independent terminator in PA1414. g, Colony biofilm growth of ΔsicX harbouring different sicX mutations under anaerobic conditions. n = 4 independent experiments. h, Comparative proteomic study identifies the targets of SicX under both static and anaerobic conditions. i, β-galactosidase assay evaluating the translational control of SicX on ubiUVT under anaerobic conditions (n ≥ 4). j, β-galactosidase assay evaluating the transcription of ubiUVT in the absence of SicX or Anr under static conditions (n ≥ 8). k, Quantification of anaerobic UQ9 synthesis in different strains (n = 4). l, A model of dual regulation of ubiUVT expression by Anr and SicX. Error bars represent standard deviation from the mean. Significant differences (compared to the WT) are indicated with asterisks (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; two-tailed Mann–Whitney test)./p>108 colony-forming units (CFUs) g−1; Fig. 3c). However, among mice carrying a high wound burden (>108 CFUs g−1), ΔsicX caused more systemic infection (12 out of 15) compared to WT (2 out of 11), indicating that dissemination did not solely depend on the wound burden (two-tailed Fisher’s exact test, P = 0.0043; Fig. 3c). Moreover, these observations are not due to differential fitness of WT and ΔsicX in spleens. This was demonstrated using an acute skin infection model in which systemic infection occurs shortly after subcutaneous injection into the mouse inner thigh. In this model, WT and ΔsicX exhibited similar colonization and growth in spleens (Extended Data Fig. 6). Taken together, our data indicate that SicX is a key player in P. aeruginosa chronic infection, the high expression of which promotes chronic localized infection./p>90% and query coverage values of >90% were retained for further analysis. Sequences of sicX and ubiUVT orthologues were aligned using MUSCLE43. To analyse the sequence conservation of sicX and ubiUVT orthologues, we first aligned sicX and ubiUVT orthologues using MUSCLE. Next, alignment ends were trimmed and gaps were removed, and percentages of orthologue sequences that are identical to sicX and ubiUVT queries were calculated at each nucleotide position in R. To create Extended Data Fig. 4b,c, the alignments were visualized in Jalview44 using the default nucleotide colour scheme./p>